國立台灣大學園藝學系大學部九十六學年度第一學期大四專題討論

題目：影響玫瑰花色之因子 系級：園藝系四年級 學號：B93608066 姓名：游之穎 時間：96年11月5日 摘要 玫瑰經人類長期的栽培育種加上本身芽條變異，產生了豐富的花色。花朵顏色主要由遺傳基因所決定，因為基因可以調控色素的生合成，而色素是影響花朵顏色的重要因素。類胡蘿蔔素 (carotenoids)及花青素 (anthocyanins)是玫瑰花裡最主要的兩類色素。而花青素化學性質較不安定，容易受溫度和pH值影響。溫度較高，花青素生合成量減少，造成花朵顏色變淡。溫度下降，花青素合成量增加，使花朵顏色變濃。光線決定光合作用的進行，光合作用影響碳水化合物的蓄積，進而影響色素的生成。此外，紫外光可以誘導花青素的生合成。剛採收的玫瑰花瓣液胞內pH值較低，花朵呈現紅色。pH值隨著組織的老化而上升，紅色的花瓣發生變藍現象 (blueing)。但由於玫瑰缺少了F3’5’H 基因，無法合成飛燕草素 (delphindin)，以致於沒有藍色的玫瑰花。藉由基因轉殖技術，將菫菜 (viola)的F3’5’H 基因轉殖到玫瑰花，因而創造了世界第一朵含有飛燕草素的藍色玫瑰花。 關鍵字：玫瑰、花色、花青素、F3’5’H 基因 rose, flower color, anthocyanin, F3’5’H gene 內容大綱 1. 前言 2. 玫瑰花色素簡述 3. 溫度及光對玫瑰花色的影響 4. 液胞中pH值變化對玫瑰花色的影響 5. 利用基因轉殖改變玫瑰花色 6. 結論 參考文獻 1. 朱建鏞、王文哲、劉興隆、李昱輝、藍啟倩、柯勇. 2005. 花色與花色素. p.106-108. In:朱建鏞、柯勇. 玫瑰花栽培. 國立中興大學農業暨自然資源學院農業推廣中心. 台中市,台灣. 2. 張石寶、胡虹、李樹云. 2001. 花卉基因工程研究進展I:花色. 雲南植物研究23(4):479-487. 3. 鄭秀敏. 1979. 紅玫瑰的花色變化. 科學月刊10(11):39-41. 4. 志佐誠、高野泰吉. 1964. バラの花色発現に及ぼす温度ならびに光の影響. J. Jpn. Soc. Hort. Sci. 33:140-146. 5. Asen, S., K. H. Norris, and R. N. Stewart. 1971. 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Oren-Shamir. 2003. Changes in anthocyanin concentration and composition in ‘Jaguar’ rose flowers due to transient high-temperature conditions. Plant Sci.164:333-340. 11. Eugster, C. H. and E. Marki-Fischer. 1991. The chemistry of rose pigments. Angew. Chem. 30:654-672. 12. Holton, T. A. and E. C. Cornish. 1995. Genetics and biochemistry of anthocyanin biosynthesis. Plant Cell 7:1071-1083. 13. Katsumoto, Y., M. Fukuchi-Mizutani, Y. Fukui, F. Brugliera, T. A. Holton, M. Karan, N. Nakamura, K. Yonekura-Sakakibara, J. Togami, A. Pigeaire, G.. Q. Tao, N. S. Nehra, C. Y. Lu, B. K. Dyson, S. Tusda, T. Ashikari, T. Kusumi, J. G. Mason, and Y. Tanaka. 2007. Engineering of the rose flavonoid biosynthetic pathway successfully generated blue-hued flowers accumulating delphinidin. Plant Cell Physiol Advance Access published on October 9, 2007, doi:10.1093/pcp/pcm131. 14. Maekawa, S., M. Terabun, and N. Nakamura. 1980. 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Euphytica 29:115-120. 短暫浸漬系統在組織培養大量繁殖之應用 短暫浸漬系統在組織培養大量繁殖之應用 國立台灣大學園藝系研究所九十六學年度第一學期專題討論 題目：短暫浸漬系統在組織培養大量繁殖之應用 姓名：王簾涵 日期：96年10月31日 指導老師：許圳塗 教授 地點：花卉館B1 摘要 使用傳統組織培養技術繁殖，雖然可以在無菌的環境下讓植物大量繁殖，但是往往受限於容器大小，以及約4-6週需要繼代培養更新培養基內容，而使繁殖所需時間與花費提高。短暫浸漬系統的研發，改善了以液體培養基培養所造成培植體玻璃質化、需氧量不足的問題，在使用上可以應用於體胚發生(香蕉)、芽體的增生(百合)以及塊莖的形成(馬鈴薯)，並且確實提高繁殖的倍率，縮短原本以半固體培養基培養需的時間，進而降低生產所需成本。 Abstract Temporary immersion has positive effects on all stages of shoot proliferation and microcuttings, microtuberization and somatic embryogenesis with many plant species. It also generally improves plant material quality. The most decisive parameter for system efficiency is immersion time. Controlling immersion times can improve hyperhydricity which is seriously affects cultures in liquid medium. Plant cell and tissue growth and proliferation rates are generally better than those obtained on agar media or in bioreactors. 內容大綱 一、前言—短暫浸漬系統簡介 短暫浸漬系統在使用特性上可以分為四個種類，1.傾斜搖動的機械裝置2.完全淹灌植物材料及更新培養基養份3.局部浸漬植物材料及液體養分的更新4.藉由氣體壓力完全浸漬培植體並不更新培養基。目前較常使用的浸漬系統包括APCS、RITA®、BTBB以及Twin flasks等。 二、短暫浸漬系統影響培植體生長之探討 由TIS系統本身影響培植體生長與發育之原因，大致上可以分為浸漬的時間長短與頻率、培養容器的大小、液體培養基的體積以及通氣條件等因素。例如以TIS 培養孤挺花芽體增殖，每星期補充液體培養基中蒸發的水量，繁殖倍率較其他方式培養優良，並且達顯著差異(Ilczuk et al, 2005) ；以TIS增殖香茅不定芽，每24小時浸漬6次可將鮮重較半固體培養提高6.6倍(Quiala et al., 2006)；而海蔥屬作物則是在培養基容量為500mL每24小時浸漬1次，每個培植體所產生芽體數可達14.81±0.5個(Kongbangkerd et al., 2006)。 三、短暫浸漬系統在不同種作物繁殖之應用 根據各國學者研究顯示，大多數的作物若使用短暫浸漬系統培養，在合適的條件下，生長率皆高於使用液體或是半固體培養基。如咖啡及香蕉利用TIS系統培養，繁殖倍率分別可以達到6.8±0.73以及5.2±0.85倍；桉樹屬利用TIS培養叢生芽體可縮短培養所需時間約一週(McAlister et al., 2005) ；而馬鈴薯利用RITA®進行培養，則可以較其他培養方式縮短繁殖所需時間(Teisson et al, 1996) 。 四、結果與討論 就多數作物種而言，使用短暫浸漬系統能夠有效提高繁殖倍率、減少繼代所耗費人力並且加速繁殖所需時間。而利用浸漬時間長短及頻率，則可以解決因為長時間淹灌在液體培養基中，造成培植體玻璃質化；以及使用半固體培養基，造成材料接觸培養基及空氣不均勻的現象，進而改善組織培養提高經濟效應。如能將此系統應用作物石蒜上，改善幼年期長、生長速度緩慢以及繁殖所需時間較長等問題，必能提高繁殖效率，並能縮短育種時間及推廣繁殖之應用。 參考文獻 1. Elio, Jimenez Gonzalez. 2005. Mass propagation of tropical crops in temporary immersion systems. In: Liquid Culture Systems for in vitro Plant propagation. A. K. Hvoslef-Eide and W. Preil(Eds). Dordrecht, Springer: 197-211. 2. Ilczuk, A., T. Winkelmann, S. Richartz, M. Witomska and M. Serek. 2005. In vitro propagation of Hippeastrum x chmielii Chm. – influence of flurprimidol and the culture in solid or liquid medium and in temporary immersion systems. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 83: 339–346. 3. Kongbangkerd, A. and C. Wawrosch. 2003. Improved shoot regeneration from nodules of Charybdis numidica in a temporary immersion system. J. Hort. Sci. Biot. 78:650-655. 4. Lian, M. L., D. Chakrabarty. and K. Y. Paek. 2003. Bulblet formation from bulbscale segments of Lilium using bioreactor system. Biol. Plant 46:199-203. 5. McAlister, B., J. Finnie, M.P. Watt and F. Blakeway. 2005. Use of the temporary immersion bioreactor system (RITA) for production of commercial Eucalyptus clones in Mondi Forests (SA). Plant Cell Tiss. Org. Cult. 81: 347–358. 6. Millam, S., O. Bohuš. and A. Preťova. 2005. Plant cell and biotechnology studies in Linum usitatissimum - a review. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 82: 93–103. 7. Teisson, C., D. Alvard, B. Berthouly, F. Cote, J.V. Escalant, H. Etienne and L. M.. 1996. Simple apparatus to perform plant tissue culture by temporary immersion. Acta Horticulturae 440: 521-526 8. Teisson, C. and D. Alvard. 1999. In vitro production of potato microtubers in liquid medium using temporay immersion. Potato Res. 42: 499–504. 石蒜雙核型雜種2n=18 (4M+3T+11A)雄配子形成遺傳重組GISH分析 2007-05-07 r94628107 點擊: 423 石蒜雙核型雜種2n=18 (4M+3T+11A)雄配子形成遺傳重組GISH分析 國立台灣大學園藝學研究所九十五學年度作物組專題討論(下) 題目:石蒜雙核型雜種2n=18 (4M+3T+11A)雄配子形成遺傳重組GISH分析 指導老師: 許圳塗 鍾美珠 博士 地點:花卉館B1教室 報告學生: 張淯茱 時間: 96年5月9日 摘 要 金花石蒜(Lycoris aurea) M T型與A核型種間雜交育成M T-A雙核型雜種2n=18(4M+3T+11A)，其雄配子檢定有部分雄稔性。以基因組原位雜交法(Genomic in situ hybridization; GISH) 檢視其回收雄配子染色體M T與A基因組間重組率為70.48 %，其中單點互換率為72.65%，雙點互換率為56.41%。頻繁的基因互換，可知石蒜核型的高度歧異化並未完全阻斷基因間之交流。藉此單向之可稔性，能開創新核型，並提供多樣性的基因組合，增加變異以提高選拔機會。 Abstract The interspecific hybridization between two divergent species Lycoris aurea 2n=14=4M+3T and Lycoris radiate 2n=22=22A obtained dikaryotype hybrid 2n=18=4M+3T+11A, this dikaryotype exhibited partially male fertility. Using GISH to detecting MT and A genome recombination rate is 70.48% in recover male gametes, in which 72.65% is single crossing-over and 56.41% is double crossing-over. Lycoris karyotypes diversity isn’t blocking gene flow across each other by gene recombination. According to partially male fertility, it can create numerous neokaryotype and use as breeding bridge benefit for variability selection. 內容大綱 ㄧ、前言 石蒜類(Lycoris Herb.)為石蒜科(Amaryllidaceae) 石蒜屬植物。石蒜種源全世界約有20餘種(Kurita, 1988)，依核型分類可分為M T、A及M T-A三大群。由配子核型分析顯示M T-A雙核型雜種染色體重組能產生多樣新核型(Neokaryotype)，但仍欠缺M T及A 之基因重組資料，故本研究利用GISH分子技術分析探討，並期以GISH技術佐證已建立染色體重組模式的可靠性，同時與基因組含量分析配合45S rDNA標記探討石蒜核型歧異化之方向。 二、前人研究 (一) 石蒜染色體組特性與核型歧異化 Kurita (1986)以中位染色體M (large metacentrics)、近末端染色體T (telocentrics)與末端染色體A (acrocentrics)來記錄石蒜染色體形態，並使用m、T'、A'來描述其餘變形之染色體，此為現今通用之核型代號。染色體藉由短縮、加長、段截、易位、轉座、融合或是裂解的方式造成染色體核型歧異化(吳, 2001; Kurita, 1998)。 (二) M T-A雙核型雜種稔實性與減數分裂配對模式 M T-A雙核型雜種2n=18(4M+3T+11A)，其雖為不稔性無法結實，但檢定有部分雄稔性(Shii et al., 1997)。觀察第一減數分裂中期有32.2%配對方式為四對M-2A三元雙價體與三對T-A結合之異源雙價體(Takemura, 1962)，依據此七對異型配對模式(hepta-heteromorphic synapsis)能產生平衡配子，即配子染色體數目維持11大臂原則，理論上可形成27=128型有機能雄配子(阮, 2000)。 三、試驗結果 (一) 石蒜染色體核型歧異化之方向 據雙核型雜種染色體觀察，染色體長度以A型染色體較短，T型次之，而M型染色體較大，並由DAPI染色可知T型染色體近中節處結構特殊。A核型群種內歧異化亦呈現出45S rDNA位點數目多型性，有2-4個位點的變化，在MT核型種內，所有T型染色體末端均有45S rDNA標記。由回收雄配子45S rDNA之標記，可知座落於A與T染色體之45S rDNA組成相異。基因組原位雜交觀察有兩A型染色體融合為一條M型染色體。基於上述理由，推測A型染色體為石蒜染色體之原始型。 (二) 雙核型雜種之遺傳重組模式 染色體經過重排重組後，染色體形態、長度與基因組大小均有所改變，經GISH檢定能了解兩基因組之交流對石蒜核型歧異化之影響。M、T與A染色體基因重組率分別為69.77 %、62.16 %、74.42 %，M兩臂長度平均值與T、A長臂長度平均值分別為16.61µm、15.06µm及10.75µm，經基因重組此三型染色體長度平均值分別為13.98µm、13.57µm與12.91µm，可知基因重組造成M與T染色體長度縮短，而造成A染色體加長。 M及T染色體與A染色體長度差異甚大，且基因組含量分別為67.40 pg與52.35 pg，即使兩基因組極為相似，同源染色體配對有其困難度。由染色體互換位點可推測M-A染色體配對鬆弛，而T-A染色體異質性高，染色體非齊頭式配對。 本研究顯示近同源(homoeologous)染色體經由七對異型配對方式，仍有機會產生平衡配子，並經由染色體置換引起基因交流，有助新性狀產生，增加多樣性。 參考文獻 1. 吳旻靜. 2001. 石蒜屬雙核型種之稔性及配子核型分析. 國立台灣大學園藝所碩士論文. 2. 阮明淑. 2000. 金花石蒜及相關種遺傳歧異性分析及核型重塑之研究. 國立台灣大學園藝所博士論文. 3. 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Al-Mukhtar, F. A., F. M. Hummadi, and F. H. Al-Sahaf. 1988. Effect of different levels of NPK fertilizer on growth and yield of two summer squash cultivars. Acta Hort. 220:253-258. 2. Alwan, O. K. 1986. Effect of nitrogen fertilization and yield of summer squash (Cucurbita pepo L.). M. Sci. Thesis. Hort. Dept. Univ. of Iraq. 3. Anghinoni, I. and Barber S. A. 1988. Corn root growth and nitrogen uptake as affected by ammonium placement. Agron. J. 80:799-802. 4. Bradley, G.. A., E. C. Barker, and D. R. Motes. 1976. Cultural and fertilizer studies on summer squash. Arkansas Farm Res. 25:11. 5. Buwalda, J. G.. 1987. The control of growth of hybrid squash (Cucurbita maxima L. cv. Delica) by nitrogen. J. Plant Nutrition. 10:1843-1851. 6. Chance, W. O. III, Z. C. Somda, and H. A. Mills. 1999. Effect of nitrogen form during the flowering period on zucchini squash growth and nutrient element uptake. J. Plant Nutrition. 22:597-607. 7. Colla, G., S. Fanasca, A. L. Molle, and F. Saccardo. 2004. 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Sci. 113:864-869. 發光二極體 (LED)在園藝上的應用 2007-10-19 B93608059 點擊: 452 發光二極體 (LED)在園藝上的應用 國立台灣大學園藝學系大學部專題討論 題目：發光二極體 (LED)在園藝上的應用 系級：園藝系四年級 學號：B93608059 姓名：黃偉利 時間：96年10月22日 摘要 在農業照明上，傳統高壓鈉燈 (high pressure sodium lamp, HPS)及螢光燈管 (tubular fluorescent lamp, TFL)為普遍的人工光源。但礙於其低光電轉換效率和高照光成本，尋找穩定光質與光量的光源，作為園藝作物生產照明有極迫切的需求。近年來，隨著光電技術的躍進，發光二極體 (light-emitting diode, LED)的亮度與效率大幅提升，增加了它在園藝上的應用性。發光二極體擁有可調整光量 (light intensity)、光質 (light quality, 紅/藍光比例或紅/遠紅光比例)、冷卻負荷低等特性，相較於目前使用之螢光燈或高壓鈉燈等光源系統，具有高光電轉換效率、體積小、壽命長、使用直流電、波長固定與低發熱等幾項優點，且較為環保。因此對需要環控的農業生產環境 (如植物組織培養室、植物生長箱及環控貨櫃等)是一種非常適合的人工光源。目前，LED在作物栽培的研究越來越多，許多作物已證實可成功的應用LED來栽培，包括萵苣、胡椒、胡瓜、小麥、菠菜、虎頭蘭、草莓、馬鈴薯、蝴蝶蘭、東方百合、白鶴芋及藻類等。而培養箱、LED組裝模式、環控儲運設備等專利產品也陸續被開發。 關鍵字：發光二極體、高壓鈉燈、螢光燈、微體繁殖 Key words: light-emitting diode, high pressure sodium lamp, tubular fluorescent lamp, micropropagation 內容大綱 1. 前言 2. LED在園藝研究方面的成果 3. LED在園藝產業之實際利用 4. LED的一些農業專利產品 5. 結論 參考文獻 1. 方煒、饒瑞佶. 2004. 高亮度發光二極體在生物產業之應用. 中華農學會報5 (5):432-446. 2. 陳金男. 2005. 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Food Chem. 101:1753-1758. 香蕉ABC轉運蛋白基因之表達與功能分析 2007-04-23 r95628103 點擊: 718 香蕉ABC轉運蛋白基因之表達與功能分析 國立臺灣大學園藝學研究所九十五學年度作物組專題討論(下) 題 目:香蕉ABC轉運蛋白基因之表達與功能分析 指導老師:黃鵬林 博士、杜宜殷 博士 學 生:林孟均 學 號:R95628103 日 期:2007/04/25 地 點:4-205 摘要 ABC轉運蛋白 (ATP-Binding Cassette transporter) 為一種與ATP結合並從事主動運輸的膜蛋白，許多研究指出，此蛋白與植物抗逆境、抗病及許多物質的運輸有關。香蕉為台灣重要的經濟果樹之一，常受到生理逆境影響其品質，因此本論文希望藉由基因過量表現、蛋白質定位及蛋白功能分析，了解此蛋白在香蕉植株中的功能，將來可運用於作物品種改良。 一、前言 香蕉 (Musa spp.) 為芭蕉科 (Musaceae) 單子葉作物，是台灣重要的經濟果樹，香蕉的生長過程易遭受寒害及其他生理逆境影響其品質，降低農民收益。在許多研究中，指出ABC轉運蛋白與抗逆境、抗病以及許多物質的運輸有關，本試驗希望透過探討該基因表現與表達，釐清其在香蕉植株中扮演之角色，期能運用於作物之品種改良。 二、研究背景 (一)ABC轉運蛋白 ABC轉運蛋白是一種普遍存在於有機體的蛋白質，其需要結合ATP並從事主動運輸，負責運輸多種不同基質通透生物膜，如生物鹼、胺基酸、重金屬螯合物、無機離子、脂質、胜肽以及糖 (Higgins, 1992) 。ABC轉運蛋白具有兩個結構，其一為NBD區 (nucleotide-binding domain) ，可與ATP結合；另一區為TMD區 (trans-membrane domain)，多為位於膜上的高度疏水區，會在膜上形成通道，專一性的提供基質通過 (Higgins, 1992)。 (二) 桿狀病毒表達載體系統 桿狀病毒表達載體系統 (baculovirus expressing vector system；BEVS) 年由Smith和Summers (1983) 所建立，此系統之桿狀病毒屬A群中的核多角體病毒，核多角體病毒的遺傳物質為雙股DNA，分子量約為80~100 kDa，宿主為無脊椎動物。相較於細菌及酵母菌，此蛋白質表達系統可容納較大的外源基因片段 (約10 kb) ，且能進行蛋白質轉錄後修飾作用，具有切除訊息蛋白序列 (signal peptide) 的作用，使蛋白質正確的折疊 (folding) ，因此目前已廣泛應用在巨分子外源蛋白及膜蛋白的表達研究上。 (三)香蕉ABC轉運蛋白基因之選殖與分析 香蕉ABC轉運蛋白基因Mh-ABC1，經北方雜交分析，已知可受IAA 、 ABA、低溫、重金屬及鹽類誘導表現(蔡，2001) 。進行Mh-ABC1啟動子:: GUS構築，並推測出Mh-ABC1啟動子會受到IAA、BA、Mannitol、ZnSO4、NaCl及KCl誘導表現，且在啟動子中可能含有抑制下游基因表達之抑制因子 (李，2004) 。Al3+、Cu2+及Ca2+對於Mh-ABC1啟動子之活性有正向誘導的效果，推測在50mM Al3+以及 Ca2+誘導下會破壞植物體內鈣離子的平衡，而誘導Mh-ABC1表現 (葉，2006) 。以香蕉基因專一性片段為探針，以溶斑雜交法篩選香蕉cDNA庫，得到兩類的ABC轉運蛋白cDNA，第一類代表性選殖系為pMaABC-29，總長度為4731bp，可演繹出全長1452個胺基酸，預測蛋白質分子量163kDa，等電點為8.20；第二類代表性選殖系為pMaABC-74p，總長度為4760bp，可演繹出全長1468個胺基酸，預測蛋白質分子量165kDa，等電點為8.50 (葉，2006) 。 三、試驗設計 (一) ABC轉蛋白生理功能分析 1. 基因功能分析 以CaMV 35S promoter接上香蕉ABC轉運蛋白cDNA，並將其轉殖入模式植物阿拉伯芥及菸草，期藉由過量表達 (overexpression) ABC轉運蛋白，了解其功能與活性。 2. 蛋白質定位 將香蕉ABC轉運蛋白cDNA構築於綠色螢光蛋白 (green fluorescent protein, GFP) 表達載體，轉植至洋蔥及香蕉細胞，透過觀察融合蛋白 (fusion protein) 的位置，了解香蕉ABC轉運蛋白在植物中之表達位置。 (二) ABC轉運蛋白之生化活性分析 將香蕉ABC轉運蛋白cDNA構築於桿狀病毒表達載體，大量表達ABC轉運蛋白，用以純化蛋白製造抗體，作為蛋白質功能分析之工具，並且進一步建立該蛋白質之生化活性分析系統，以分析該蛋白之基質種類。 四、試驗成果 目前已完成五個質體構築，分別為pUCRT99gus、pUCRT29、pGKU29、pUCRT74p以及pGKU74p。其中pGKU29與pGKU74p為最終質體，分別是將葉 (2006) 所篩選到的cDNA—pMaABC-29及pMaABC-74p，與CaMV 35S promoter以及GUS報導基因構築而成。將構築完成的載體pGKU29與pGKU74p轉型至農桿菌LBA4404及EHA105，經限制酶酶切以及聚合酶連鎖反應 (polymerase chain reaction, PCR) 已確認目標質體轉型至農桿菌。另一方面，目前已構思完成GFP表達載體的構築策略。 五、未來研究方向 基因過量表現方面，將進行觀察轉殖株的外觀、生理變化及抗病能力；蛋白質定位方面，暫時性轉殖分析，確認ABC轉運蛋白在細胞內表達的位置；蛋白質生化活性分析方面，以桿狀病毒表達載體表達此蛋白，並進行純化與抗體的製作。 參考文獻 1. 蔡嘉慧. 2001. 香蕉ABC轉運蛋白基因之分析. 國立臺灣大學園藝學研究所碩士論文. 2. 李幸儒. 2004. 香蕉ABC轉運蛋白基因啟動子之活性分析. 國立臺灣大學園藝學研究所碩士論文. 3. 葉曉君. 2006. 香蕉ABC轉運蛋白cDNA之選殖及基因啟動子之活性分析. 國立臺灣大學園藝學研究所碩士論文. 4. 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